Hotstart Taq DNS polimeráz
A Hot Start Taq DNS-polimeráz (antitest-módosítás) a Thermus aquaticus YT-1-ből származó, melegindítású, hőstabil DNS-polimeráz, amely 5′→3′ polimeráz aktivitással és 5′-es lebeny-endonukleáz aktivitással rendelkezik.A hot-start Taq DNS polimeráz egy Taq DNS polimeráz, amelyet termolabilis Taq antitestek módosítottak.Az antitest módosítása növelte a PCR specificitását, érzékenységét és hozamát.
Alkatrészek
| Összetevő | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq puffer | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNS-polimeráz (antitesttel módosított) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Alkalmazások
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 25 °C-on), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 és 50% glicerin.
Raktározási feltételek
Szállítás 0°C alatt és -25°C--15°C között tárolandó.
Mértékegység meghatározása
Egy egység az az enzimmennyiség, amely 15 nmol dNTP-t épít be savban oldhatatlan anyagba 30 perc alatt 75 °C-on.
Minőség ellenőrzés
1.Endonnukleáz aktivitás:20 U enzim 4 μg pUC19 DNS-sel inkubálása 4 órán át 37°C-on nem eredményezett kimutatható DNS degradációt, amint azt gélelektroforézissel meghatároztuk.
2.5 kb Lambda PCR:5 ng lambda DNS PCR amplifikációjának 25 ciklusa 1,25 egység Taq DNS polimerázzal 200 µM dNTP és 0,2 µM primerek jelenlétében a várt 5 kb méretű terméket eredményezi.
3.Exonukleáz aktivitás:Egy legalább 12,5 U Taq DNS-polimerázt tartalmazó 50 µl-es reakció 10 nmol 5'-FAM oligonukleotiddal történő inkubálása 30 percig 37 °C-on nem eredményez kimutatható lebomlást.
4.RNáz aktivitás:A 20 U enzimet tartalmazó, 10 µl-es reakcióelegy 1 µg RNS-transzkriptumokkal történő inkubálása 2 órán át 37 °C-on nem eredményezte az RNS kimutatható lebomlását, amint azt gélelektroforézissel meghatároztuk.
5.Hő inaktiválás:Nem.
Reakciórendszer
| Alkatrészek | Hangerő |
| Sablon DNSa | választható |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP keverék (egyenként 10 mM) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq puffer | 5 μL |
| Taq DNS polimerázb(5E/μL) | 0,125 μl |
| Nukleázmentes víz | 25 μL-ig |
Megjegyzések:
1) a.
| DNS | Összeg |
| Genomiális | 1 ng-1 μg |
| Plazmid vagy vírusos | 1 pg-1 ng |
2) b.A Taq DNS-polimeráz optimális koncentrációja 5-50 egység/ml (0,1-0,5 egység/25 µL reakció) között változhat speciális alkalmazásokban.
Termikus kerékpározási protokoll
PCR
| Lépés | Hőfok(°C) | Idő | Ciklusok |
| Kezdeti denaturációa | 95 ℃ | 1-3 perc | - |
| Denaturáció | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Ciklusok |
| Lágyításb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Kiterjesztés | 68 ℃ | 1kb/perc | |
| Végső kiterjesztés | 68 ℃ | 5 perc | - |
Megjegyzések:
1) Egy 1 perces kezdeti denaturáció 95 °C-on elegendő a legtöbb amplifikációhoz.Nehéz sablonok esetén hosszabb, 2-3 perces denaturálás javasolt 95°C-on.Kolónia-PCR esetén a kezdeti 5 perces denaturálás 95°C-on javasolt.
2) A lágyítási lépés jellemzően 15-60 másodperc.Az izzítási hőmérséklet az alapozópár Tm-jén alapul, és jellemzően 45-68 ℃.
