Proteináz K (folyékony)
Katalógusszám: HC4502A
A proteináz K egy stabil szerin proteáz, széles szubsztrátspecifitással.Sok fehérjét natív állapotban detergensek jelenlétében is lebont.A kristály- és molekulaszerkezeti vizsgálatokból származó bizonyítékok azt mutatják, hogy az enzim a szubtilizin családba tartozik, aktív hely katalitikus triáddal (Asp39-Övé69- Ser224).A hasítás domináns helye a blokkolt alfa-aminocsoportokkal rendelkező alifás és aromás aminosavak karboxilcsoportjával szomszédos peptidkötés.Általában széles körben használjáksajátosság.
Leírás
| Kinézet | Színtelen vagy világosbarna folyadék |
| Tevékenység | ≥800 U/ml |
| Fehérje koncentráció | ≥20 mg/ml |
| DNS-áz | Egyik sem észlelhető |
| RNáz | Egyik sem észlelhető |
Tárolási feltételek
2-8 ℃ közötti hőmérsékleten tárolandó.
Tulajdonságok
| EK szám | 3.4.21.64 (Rekombináns a Tritirachium albumból) |
| Molekuláris tömeg | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektromos pont | 7.81 |
| Optimális pH | 7,0-12,0 1. ábra |
| Optimális hőmérséklet | 65 ℃ 2. ábra |
| pH stabilitás | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 óra) 3. ábra |
| Hőstabilitás | 50 ℃ alatt (pH 8,0, 30 perc) 4. ábra |
| Aktivátorok | SDS, karbamid |
| Inhibitorok | diizopropil-fluor-foszfát;fenil-metil-szulfonil-fluorid |
Alkalmazások
1. Genetikai diagnosztikai készlet
2. RNS és DNS extrakciós készletek
3. Nem fehérje komponensek kinyerése a szövetekből, fehérje szennyeződések lebontása, például DNS-vakcinák és heparin készítése
4. Kromoszóma DNS előállítása pulzáló elektroforézissel
5. Western blot
6. Enzimatikus glikozilált albumin reagensek in vitro diagnosztikája
Óvintézkedések
Használat vagy mérlegelés közben viseljen védőkesztyűt és védőszemüveget, és használat után jól szellőztessen.Ez a termék allergiás bőrreakciót és súlyos szemirritációt okozhat.Belélegezve allergiás vagy asztmás tüneteket vagy nehézlégzést okozhat.Légúti irritációt okozhat.
Próba
Mértékegység meghatározása
Egy egység (U) az az enzimmennyiség, amely a kazein hidrolizálásához szükséges percenként 1 μmol tirozin előállításához a következő feltételek mellett.
Reagensek előkészítése
I. reagens: 1 g tejkazeint 50 ml 0,1 M nátrium-foszfát-oldatban (pH 8,0) oldunk, 65-70 ℃-os vízben 15 percig inkubáljuk, keverjük és feloldjuk, vízzel lehűtjük, nátrium-hidroxiddal pH 8,0-ra állítjuk, majd rögzítjük. térfogata 100 ml.
II. reagens: TCA-oldat: 0,1 M triklór-ecetsav, 0,2 M nátrium-acetát, 0,3 M ecetsav.
III reagens: 0,4 M Na2CO3megoldás.
IV. reagens: Forint reagens tiszta vízzel 5-ször hígítva.
V. reagens: Enzim hígító: 0,1 M nátrium-foszfát oldat (pH 8,0).
VI. reagens: tirozin oldat: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozin 0,2 M sósavval oldva.
Eljárás
1. 0,5 ml I. reagenst előmelegítünk 37 °C-ra, adjunk hozzá 0,5 ml enzimoldatot, jól keverjük össze, és 37 °C-on 10 percig inkubáljuk.
2. Adjon hozzá 1 ml II. reagenst a reakció leállításához, keverje jól össze, és folytassa az inkubálást 30 percig.
3. Centrifugálja a reakcióoldatot.
4. Vegyünk 0,5 ml felülúszót, adjunk hozzá 2,5 ml III reagenst, 0,5 ml IV reagenst, jól keverjük össze, és inkubáljuk 37 °C-on 30 percig.
5. OD660OD-ként határoztuk meg1;vak kontrollcsoport: 0,5 ml V reagenst használunk az enzimoldat helyettesítésére az OD meghatározásához660mint OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozin standard görbe: 0,5 ml különböző koncentrációjú L-tirozin oldat, 2,5 ml III reagens, 0,5 ml IV reagens 5 ml-es centrifugacsőben, inkubálás 37 ℃-on 30 percig, OD detektálása660az L-tirozin különböző koncentrációira, majd megkapta az Y=kX+b standard görbét, ahol Y az L-tirozin koncentrációja, X az OD600.
Számítás
2: A reakcióoldat teljes térfogata (ml)
0,5: Az enzimoldat térfogata (ml)
0,5: A kromogén meghatározáshoz használt reakciófolyadék térfogata (ml)
10: Reakcióidő (perc)
Df: Hígítás többszörös
C: Enzimkoncentráció (mg/ml)
Hivatkozások
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Ábrák
Ábra. 1 Optimális pH
100 mM pufferoldat: pH 6,0-8,0, Na-foszfát;pH 8,0-9,0, Trisz-HCl;pH 9,0-12,5, glicin-NaOH. Enzimkoncentráció: 1 mg/ml
2. ábra Optimális hőmérséklet
Reakció 20 mM K-foszfát pufferben, pH 8,0.Enzimkoncentráció: 1mg/ml
3. ábra pH Stabilitás
25 ℃, 16 órás kezelés 50 mM pufferoldattal: pH 4,5-5,5, Acetát;pH 6,0-8,0, Na-foszfát;pH 8,0-9,0, Trisz-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Enzimkoncentráció: 1mg/ml
4. ábra Termikus stabilitás
30 perces kezelés 50 mM Tris-HCl pufferrel, pH 8,0.Enzimkoncentráció: 1mg/ml
5. ábra Tárolás stability at 25℃
