Rnáz inhibitor
Az egér RNáz inhibitor egy rekombináns egér RNáz inhibitor E. coliból expresszálva és tisztítva.Nem kovalens kötéssel 1:1 arányban kötődik az RNáz A-hoz, B-hez vagy C-hez, ezáltal gátolja a három enzim aktivitását és megvédi az RNS-t a lebomlástól.Azonban nem hatásos az Aspergillusból származó RNáz 1, RNáz T1, S1 nukleáz, RNáz H vagy RNáz ellen.Az egér RNáz inhibitort RT-PCR-rel, RT-qPCR-rel és IVT mRNS-sel tesztelték, és kompatibilis volt különféle kereskedelmi reverz transzkriptázokkal, DNS polimerázokkal és RNS polimerázokkal.
A humán RNáz inhibitorokhoz képest az egér RNáz inhibitor nem tartalmaz két ciszteint, amelyek nagyon érzékenyek az oxidációra, ami az inhibitor inaktiválását okozza.Ez stabillá teszi alacsony DTT-koncentrációnál (kevesebb, mint 1 mM).Ez a tulajdonsága alkalmassá teszi olyan reakciókban történő alkalmazásra, ahol a DTT nagy koncentrációja káros a reakcióra (pl. valós idejű RT-PCR).
Aalkalmazás
Ez a termék széles körben alkalmazható minden olyan kísérletben, ahol az RNáz interferencia lehetséges az RNS lebomlásának elkerülése érdekében, mint például:
1.A cDNS első szálának szintézise, RT-PCR, RT-qPCR stb.
2.Megvédi az RNS-t a lebomlástól az in vitro transzkripció/transzláció során (pl. in vitro vírusreplikációs rendszer).
3.Az RNáz aktivitás gátlása az RNS elválasztás és tisztítás során.
Tárolási feltételek
A termék -25～- 15 ℃-on tárolható, 2 évig érvényes.
Tárolópuffer
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT és 50% glicerin.
Mértékegység meghatározása
Az 5 ng ribonukleáz A aktivitásának 50%-os gátlásához szükséges egér RNáz inhibitor mennyiségét egy egységben (U) határoztuk meg.
A fehérje molekulatömege
Az egér RNáz inhibitor molekulatömege 50 kDa.
Minőség ellenőrzés
Exonukleáz Tevékenység:
40 U rágcsáló RNáz inhibitor 1 μg λ-Hind III emésztett DNS-sel 37 °C-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.
Endonukleáz aktivitás:
40 U rágcsáló RNáz inhibitor 1 μg λ DNS-sel 37 °C-on 16 órán át, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.
Nicking Tevékenység:
40 egység rágcsáló RNáz inhibitor 1 μg pBR322-vel 37 °C-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.
RNáz Tevékenység:
40 egység rágcsáló RNáz inhibitor 1,6 μg MS2 RNS-sel 4 órán át 37 °C-on, agaróz gélelektroforézis alapján nem bomlik le.
E.coli DNS:
40 U rágcsáló RNáz inhibitort E. coli genomiális DNS jelenlétére szkrínelünk TaqMan qPCR alkalmazásával, az E. coli 16S rRNS lókuszra specifikus primerekkel.Az E. coli genomi DNS-szennyezettsége ≤ 0,1 pg/40 U.
Nmegjegyzéss
1. Heves oszcilláció vagy keverés az enzimek inaktiválásához vezet.
2. Ennek az inhibitornak az optimális hőmérsékleti tartománya 25-55 ℃ volt, és 65 ℃ feletti hőmérsékleten inaktiválódott.
3. Az RNáz H, RNáz 1 és RNáz T1 aktivitását nem gátolta rágcsáló RNáz inhibitor.
4. Az RNáz aktivitás gátlása széles pH-tartományban volt tapasztalható (pH 5-9 mindegyik aktív volt), és a legnagyobb aktivitást pH 7-8 között figyeltük meg.
5. Mivel a ribonukleázok jellemzően megtartják aktivitásukat denaturáló körülmények között, ügyelni kell arra, hogy elkerüljük a ribonukleázzal komplexet képező RNáz-inhibitor molekulák denaturálódását.Az aktív ribonukleáz felszabadulásának megakadályozása érdekében kerülni kell az 50 °C-nál magasabb hőmérsékletet és a karbamid vagy más denaturálószer magas koncentrációját.
