Vad Taq DNS-polimeráz
A Taq DNS-polimeráz a Thermus aquaticus YT-1-ből származó hőstabil DNS-polimeráz, amely 5′→3′ polimerázaktivitással és 5'-es lebeny-endonukleáz aktivitással rendelkezik.
Alkatrészek
| Összetevő | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq puffer | 2×1 ml | 2×10 ml | 2×50 ml | 5×200 ml |
| Taq DNS-polimeráz (5 U/μl) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Raktározási feltételek
Szállítás 0°C alatt és -25°C--15°C között tárolandó.
Mértékegység meghatározása
Egy egység az az enzimmennyiség, amely 15 nmol dNTP-t épít be savban oldhatatlan anyagba 30 perc alatt 75 °C-on.
Minőség ellenőrzés
1.Protein Purity Assay (SDS-PAGE):A Taq DNS polimeráz tisztaságát SDS-PAGE analízissel ≥95%-ban határoztuk meg.
2.Endonnukleáz aktivitás:Legalább 5 U Taq DNS polimeráz 1 μg λDNS-sel 16 órán keresztül 37 ℃-on nem eredményez kimutatható lebomlást a meghatározás szerint.
3.Exonukleáz aktivitás:Minimum 5 U Taq DNS polimeráz 1 μg λ-Hind Ⅲ emésztett DNS-sel 16 órán keresztül 37 ℃-on nem eredményez kimutatható lebomlást a meghatározás szerint.
4.Nickase tevékenység:Minimum 5 U Taq DNS polimeráz 1 μg pBR322 DNS-sel 16 órán keresztül 37°C-on nem eredményez kimutatható lebomlást a meghatározás szerint.
5.RNáz aktivitás:Minimum 5 U Taq DNS polimeráz 1,6 μg MS2 RNS-sel 16 órán keresztül 37°C-on nem eredményez kimutatható lebomlást a meghatározás szerint.
6.E. coliDNS:5 U Taq DNS polimerázt E. coli genomiális DNS jelenlétére szűrünk TaqMan qPCR alkalmazásával, az E. coli 16S rRNS lókuszra specifikus primerekkel.Az E. coli genomi DNS-szennyezettsége ≤1 Copy.
7.PCR-amplifikáció (5,0 kb lambda DNS)- 50 µl-es reakció, amely 5 ng lambda DNS-t és 5 egység Taq DNS-polimerázt tartalmaz 25 PCR-amplifikációs ciklushoz, a várt 5,0 kb-os terméket eredményezi.
Reakció beállítása
| Alkatrészek | Hangerő |
| Sablon DNSa | választható |
| 10 μM Forward Primer | 1 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 1 μL |
| dNTP keverék (egyenként 10 mM) | 1 μL |
| 10× Taq puffer | 5 μL |
| Taq DNS polimerázb | 0,25 μl |
| Nukleázmentes víz | 50 μL-ig |
Megjegyzések:
1) A különböző templátok optimális reakciókoncentrációja eltérő.Az alábbi táblázat az 50 µl-es reakciórendszer javasolt sablonhasználatát mutatja be.
| DNS | Összeg |
| Genomiális | 1 ng-1 μg |
| Plazmid vagy vírusos | 1 pg-1 ng |
2) A Taq DNS-polimeráz optimális koncentrációja speciális alkalmazásokban 0,25 µL-1 µL között lehet.
ReakcióProgram
| Lépés | Hőfok(°C) | Idő | Ciklusok |
| Kezdeti denaturációa | 95 ℃ | 5 perc | - |
| Denaturáció | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Ciklusok |
| Lágyításb | 60 ℃ | 15 s | |
| Kiterjesztés | 72 ℃ | 1kb/perc | |
| Végső kiterjesztés | 72 ℃ | 5 perc | - |
Megjegyzések:
1) A kezdeti denaturációs feltétel a legtöbb amplifikációs reakcióhoz megfelelő, és a templát szerkezetének összetettségétől függően módosítható.Ha a sablon szerkezete összetett, az elődenaturálási idő 5-10 percre meghosszabbítható a kezdeti denaturációs hatás javítása érdekében.
2) Az izzítási hőmérsékletet az alapozó Tm értékének megfelelően kell beállítani, amely általában 3-5 ℃-kal alacsonyabb, mint az alapozó Tm értéke;Összetett sablonok esetén be kell állítani a lágyítási hőmérsékletet és meg kell hosszabbítani a meghosszabbítási időt a hatékony amplifikáció eléréséhez.
