RTL reverz transzkriptáz
Az RTL reverz transzkriptáz egy RNS-templát-függő DNS polimeráz, amelyből hiányzik a 3'→5' exonukleáz aktivitás, és RNáz H aktivitással rendelkezik.Ez az enzim az RNS-t templátként használhatja a DNS komplementer szálának szintetizálására, amely alkalmazható az első szálú cDNS szintézisére, különösen az RT-LAMP (hurok által közvetített izotermikus amplifikáció) esetében.Az RTL reverz transzkriptáz 1.0-val összehasonlítva az érzékenység jelentősen javult, a hőstabilitás erősebb, és a reakció 65°C-on stabilabb.Az RTL reverz transzkriptáz (glicerinmentes) felhasználható liofilizált készítmények, liofilizált RT-LAMP reagensek stb.
Mértékegység meghatározása
Egy egység 1 nmol dTTP-t épít be savval kicsapható anyagba 20 perc alatt 50 °C-on poli(A)•oligo(dT)25-öt használva templát-primerként.
Alkatrészek
| Összetevő | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reverz transzkriptáz (glicerinmentes) (15E/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL puffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Raktározási feltételek
Szállítás 0°C alatt és -25°C--15°C között tárolandó.
Minőség ellenőrzés
- Maradék aktivitásaEndonukleáz:Egy 50 μl-es reakció, amely 1 μg λDNS-t és 15 egység RTL2.0-t tartalmaz, 16 órán át 37 ℃-on inkubálva, ugyanazt a mintát mutatja, mint a gélelektroforézissel végzett negatív kontroll.
- Maradék aktivitásaExonukleáz:Egy 50 μl-es reakció, amely 1 μg HindⅢ-emésztett λDNS-t és 15 egység RTL2.0-t tartalmaz, 16 órán át 37 ℃-on inkubálva, ugyanazt a mintát mutatja, mint a gélelektroforézissel végzett negatív kontroll.
- Maradék aktivitásaNickase:Egy 50 μl-es reakció, amely 1 μg szuperspirált pBR322-t és 15 egység RTL2.0-t tartalmaz, 4 órán át 37 °C-on inkubálva ugyanazt a mintát mutatja, mint a gélelektroforézissel végzett negatív kontroll.
- Maradék aktivitásaRNáz:Egy 10 μl-es reakció, amely 0,48 μg MS2 RNS-t és 15 egység RTL2.0-t tartalmaz, 4 órán át 37 °C-on inkubálva ugyanazt a mintát mutatja, mint a gélelektroforézissel végzett negatív kontroll.
- E. coli gDNS:-vel mérveE. colispecifikus HCD érzékelő készletek, 15 RTL2.0 egység kevesebb, mint 1E. coligenom.
Reakció beállítása
cDNS szintézis protokoll
| Alkatrészek | Hangerő |
| Templát RNS a | választható |
| Oligo(dT) 18-25 (50 uM) vagy Random Primer keverék (60 uM) | 2 μL |
| dNTP keverék (egyenként 10 mM) | 1 μL |
| RNáz-gátló (40E/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL puffer | 2 μL |
| Nukleázmentes víz | 20 μL-ig |
Megjegyzések:
1) A Total RNS ajánlott adagja 1ng-1 μg
2) Az mRNS ajánlott dózisa 50-100 ng volt
Thermo-kerékpározás A rutin feltételei reakció:
| Hőmérséklet (°C) | Idő |
| 25 °Ca | 5 perc |
| 55 °C | 10 percb |
| 80 °C | 10 perc |
Megjegyzések:
1) Ha Random Primer Mix-et használ, egy inkubációs lépést 25 °C-on.
2) Ha célprimer keveréket használunk, egy inkubációs lépést 55 °C-on 10-30 percig.
RT-LAMP Protokoll
| Alkatrészek | Hangerő | Végső koncentráció |
| Templát RNS | választható | ≥10 példány |
| dNTP keverék (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP alapozók (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 alapozók (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB alapozók (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNáz-gátló (40E/μl) | 0,5 μL | 20 U/reakció |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Reakció |
| Bst V2 DNS-polimeráz (8E/μL) | 1 μL | 8 U/Reakció |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (összesen 8 mM) |
| 10×HC RTL puffer (vagy 10×HC Bst V2 puffer) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Nukleázmentes víz | 25 μL-ig | - |
Megjegyzések:
1) Vortexeléssel keverje össze, és röviden centrifugálja az összegyűjtéshez.Állandó hőmérsékletű inkubálás 65°C-on 1 órán át.
2) A két puffer kölcsönösen átjárható, és azonos összetételű.
Megjegyzések
1. Ez a termék -20 °C-on tárolva fehér szilárd anyagot képez.Vegyük ki -20°C-ról és tegyük jégre körülbelül 10 percre.Olvadás után rázással, keveréssel használható.
2. A cDNS-termék -20 °C vagy -80 °C hőmérsékleten tárolható, vagy azonnal felhasználható PCR-reakcióhoz.
3. Az RNáz szennyeződés megelőzése érdekében tartsa tisztán a kísérleti területet, és viseljen tiszta kesztyűt és maszkot működés közben.
