Proteináz K mNGS (folyékony)
A proteináz K egy stabil szerin proteáz, széles szubsztrátspecifitással.Sok fehérjét natív állapotban detergensek jelenlétében is lebont.A kristály- és molekulaszerkezeti vizsgálatokból származó bizonyítékok azt mutatják, hogy az enzim a szubtilizin családba tartozik, aktív hely katalitikus triáddal (Asp39-Övé69-Ser224).A hasítás domináns helye a blokkolt alfa-aminocsoportokkal rendelkező alifás és aromás aminosavak karboxilcsoportjával szomszédos peptidkötés.Széles specifikussága miatt gyakran használják.Ezt a proteináz K-t kifejezetten az mNGS-hez tervezték.A többi proteináz K-vel összehasonlítva még kevesebb nukleinsav szennyezést tartalmaz, azonos enzimatikus teljesítménnyel, ami jobban biztosíthatja a downstream mNGS alkalmazást.
Tárolási feltételek
2-8℃ 2 évig
Leírás
| Kinézet | Színtelen vagy világosbarna folyadék |
| Tevékenység | ≥800 U/ml |
| Fehérje koncentráció | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Egyik sem észlelhető |
| DNS-áz | Egyik sem észlelhető |
| RNáz | Egyik sem észlelhető |
Tulajdonságok
| EK szám | 3.4.21.64(Rekombináns a Tritirachium albumból) |
| Izoelektromos pont | 7.81 |
| Optimális pH | 7,0- 12,0 1. ábra |
| Optimális hőmérséklet | 65 ℃ 2. ábra |
| pH stabilitás | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 óra) 3. ábra |
| Hőstabilitás | 50 ℃ alatt (pH 8,0, 30 perc) 4. ábra |
| Tárolási stabilitás | Több mint 90% aktivitás 12 hónapig 25 ℃-on |
| Aktivátorok | SDS, karbamid |
| Inhibitorok | diizopropil-fluor-foszfát;fenil-metil-szulfonil-fluorid |
Alkalmazások
1. Genetikai diagnosztikai készlet
2. RNS és DNS extrakciós készletek
3. Nem fehérje komponensek kinyerése a szövetekből, fehérje szennyeződések, például DNS lebontásavakcinák és heparin készítése
4. Kromoszóma DNS előállítása pulzáló elektroforézissel
5. Western blot
6. Enzimatikus glikozilált albumin reagensek in vitro diagnosztikája
Óvintézkedések
Használat vagy mérlegelés közben viseljen védőkesztyűt és védőszemüveget, és használat után jól szellőztessen.Ez a termék allergiás bőrreakciót és súlyos szemirritációt okozhat.Belélegezve allergiás vagy asztmás tüneteket vagy nehézlégzést okozhat.Légúti irritációt okozhat.
Mértékegység meghatározása
Egy egység (U) az az enzimmennyiség, amely a kazein hidrolizálásához szükséges 1 μmol előállításáhoztirozin percenként a következő feltételek mellett.
Reagensek előkészítése
I. reagens: 1 g tejkazeint 50 ml 0,1 M nátrium-foszfát-oldatban (pH 8,0) oldunk, 65-70 ℃-os vízben 15 percig inkubáljuk, keverjük és feloldjuk, vízzel lehűtjük, nátrium-hidroxid pH-ját 8,0-ra állítjuk be és rögzítettük a térfogatot. 100 ml.
II. reagens: 0,1 M triklór-ecetsav, 0,2 M nátrium-acetát, 0,3 M ecetsav.
III reagens: 0,4 M Na2CO3megoldás.
IV. reagens: Forint reagens tiszta vízzel 5-ször hígítva.
V. reagens: Enzim hígító: 0,1 M nátrium-foszfát oldat (pH 8,0).
VI. reagens: tirozin oldat: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozin 0,2M HCl.
Eljárás
1. 0,5 ml I. reagenst előmelegítünk 37 °C-ra, adjunk hozzá 0,5 ml enzimoldatot, jól keverjük össze, és inkubáljuk37 ℃ 10 percig.
2. Adjon hozzá 1 ml II. reagenst a reakció leállításához, keverje jól össze, és folytassa az inkubálást 30 percig.
3. Centrifugálja a reakcióoldatot.
4. Vegyünk 0,5 ml felülúszót, adjunk hozzá 2,5 ml III-as reagenst, 0,5 ml IV-es reagenst, jól keverjük össze, és inkubáljuk 37 °C-on.30 percig.
5. OD660OD-ként határoztuk meg1;vak kontrollcsoport: 0,5 ml V reagenst használunk az enzim helyettesítéséremegoldás az OD meghatározására660mint OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozin standard görbe: 0,5 ml különböző koncentrációjú L-tirozin oldat, 2,5 ml III reagens, 0,5 ml IV reagens 5 ml-es centrifugacsőben, inkubálás 37 ℃-on 30 percig, OD detektálása660az L-tirozin különböző koncentrációira, majd megkapta az Y=kX+b standard görbét, ahol Y az L-tirozin koncentrációja, X az OD600.
Számítás
2: A reakcióoldat teljes térfogata (ml)
0,5: Az enzimoldat térfogata (ml)
0,5: A kromogén meghatározáshoz használt reakciófolyadék térfogata (ml)
10: Reakcióidő (perc)
Df: Hígítás többszörös
C: Enzimkoncentráció (mg/ml)
Hivatkozások
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Ábrák
Ábra.1 Optimális pH
100 mM pufferoldat: pH 6,0-8,0, Na-foszfát;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glicin-NaOH. Enzimkoncentráció: 1 mg/ml
2. ábra Optimális hőmérséklet
Reakció 20 mM K-foszfát pufferben, pH 8,0.Enzimkoncentráció: 1 mg/ml
3. ábra pH Stabilitás
25 ℃, 16 órás kezelés 50 mM pufferoldattal: pH 4,5-5,5, Acetát;pH 6,0-8,0, Na-foszfát;pH 8,0-9,0, Trisz-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Enzimkoncentráció: 1 mg/ml
4. ábra Termikus stabilitás
30 perces kezelés 50 mM Tris-HCl pufferrel, pH 8,0.Enzimkoncentráció: 1 mg/ml
5. ábra Tárolás stability at 25℃
