Proteináz K NGS (por)
Katalógusszám: HC4507A
Az NGS Protease K egy stabil szerin proteáz, magas enzimaktivitással és széles szubsztrátspecifitással. Az enzim elsősorban a hidrofób aminosavak, kéntartalmú aminosavak és aromás aminosavak C-terminálisa melletti észterkötéseket és peptidkötéseket bontja le.Tehát gyakran használják fehérjék rövid peptidekké történő lebontására.Az NGS Protease K egy tipikus szerin proteáz az Asp-vel39-Övé69-Ser224katalitikus triád, amely csak a szerin proteázokra jellemző, és a katalitikus központot Ca-kóc veszi körül2+kötőhelyek a stabilizáláshoz, fenntartva a magas enzimaktivitást szélesebb körülmények között.
Leírás
| Kinézet | Fehér vagy törtfehér amorf por, liofilizált |
| Konkrét tevékenység | ≥40E/mg szilárd |
| DNS-áz | Egyik sem észlelhető |
| RNáz | Egyik sem észlelhető |
| Bioburden | ≤50 CFU/g szilárd anyag |
| Nukleinsav maradék | <5pg/mg szilárd |
Tulajdonságok
| Forrás | Tritirachium album |
| EK szám | 3.4.21.64(Rekombináns a Tritirachium albumból) |
| Molekuláris tömeg | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektromos pont | 7.81 1. ábra |
| Optimális pH | 7,0-12,0 (Minden magas aktivitást végez) 2. ábra |
| Optimális hőmérséklet | 65℃ 3. ábra |
| pH Stabilitás | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 óra) 4. ábra |
| Hőstabilitás | 50 ℃ alatt (pH 8,0, 30 perc) 5. ábra |
| Tárolási stabilitás | 25 ℃-on 12 hónapig tárolva 6. ábra |
| Aktivátorok | SDS, karbamid |
| Inhibitorok | diizopropil-fluor-foszfát;benzilszulfonil-fluorid |
Tárolási feltételek
Tárolja a liofilizált port -25 ~ -15 ℃ hőmérsékleten hosszú ideig, fénytől távol;Feloldódás után aliquotot osszon megfelelő térfogatra rövid távú tároláshoz 2-8 °C-on, fénytől távol, vagy -25-15 °C-on, fénytől távol tartva.
Óvintézkedések
Használat vagy mérlegelés közben viseljen védőkesztyűt és védőszemüveget, és használat után jól szellőztessen.Ez a termék allergiás bőrreakciót és súlyos szemirritációt okozhat.Belélegezve allergiás vagy asztmás tüneteket vagy nehézlégzést okozhat.Légúti irritációt okozhat.
Mértékegység meghatározása
Egy egység NGS Proteáz K az az enzimmennyiség, amely a kazein 1 μmol L-tirozinná történő hidrolizálásához szükséges standard meghatározási körülmények között.
Reagensek előkészítése
| Reagens | Gyártó | Katalógus |
| Kazein technikaiszarvasmarha tejből | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 10019762 |
| Nem2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 20040618 |
| Triklór-ecetsav | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 80132618 |
| Nátrium-acetát | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 10018818 |
| Ecetsav | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 10011018 |
| Nátrium-karbonát | Sinopharm ChemicalReagens Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Sanghaj)Vállalat, KFT. | A500467-0100 |
| L-tirozin | Sigma | 93829 |
I. reagens:
Szubsztrát: 1%-os kazein marhatej-oldatból: oldjunk fel 1 g szarvasmarhatej-kazeint 50 ml 0,1 M nátrium-foszfát-oldatban (pH 8,0), melegítsük vízfürdőben 65-70 °C-on 15 percig, keverjük fel és oldjuk fel, vízzel hűtsük le. nátrium-hidroxidot 8,0 pH-ra, és 100 ml-re hígítjuk.
Reagens II:
TCA-oldat: 0,1 M triklór-ecetsav, 0,2 M nátrium-acetát és 0,3 M ecetsav (mérjünk egymás után 1,64 g triklór-ecetsavat + 1,64 g nátrium-acetátot + 1,724 ml ecetsavat, adjunk hozzá 50 ml ionmentesített vizet, és a pH-t 4,0-ra hígítsuk HCl-re 100 ml).
Reagens III:
0,4 m nátrium-karbonát oldat (mérjünk le 4,24 g vízmentes nátrium-karbonátot, és oldjuk fel 100 ml vízben)
IV. reagens:
Folin fenol reagens: hígítsuk 5-ször ionmentes vízzel.
V. reagens:
Enzim hígító: 0,1 M nátrium-foszfát oldat, pH 8,0.
VI. reagens:
L-tirozin standard oldat: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozin 0,2 M sósavval oldva.
Eljárás
1. Kapcsolja be az UV-Vis spektrofotométert, és válassza ki a fotometriai mérést.
2. Állítsa be a hullámhosszt 660 nm-re.
3. Kapcsolja be a vízfürdőt, állítsa a hőmérsékletet 37 ℃-ra, biztosítsa a hőmérséklet változatlanságát 3-5 percig.
4. Melegítsen elő 0,5 ml szubsztrátumot egy 2 ml-es centrifugacsőben 37 °C-os vízfürdőn 10 percig.
5. Extraháljon 0,5 ml hígított enzimoldatot az előmelegített centrifugacsőbe 10 percig.Állítsa be az enzimhígítót üres csoportnak.
6. Közvetlenül a reakció után adjon hozzá 1,0 ml TCA-reagenst.Jól összekeverjük és 30 percig vízfürdőben inkubáljuk.
7. Centrifugálja a reakcióoldatot.
8. Adja hozzá a következő összetevőket a megadott sorrendben.
| Reagens | Hangerő |
| Felülúszó | 0,5 ml |
| 0,4 M nátrium-karbonát | 2,5 ml |
| Folin fenol reagens | 0,5 ml |
9. Jól keverje össze, mielőtt 37°C-os vízfürdőben 30 percig inkubálja.
10. OD660OD-ként határoztuk meg1;vak kontrollcsoport: Enzim hígítót használunk az enzimoldat helyettesítésére az OD meghatározásához660mint OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirozin standard görbe: 0,5 ml különböző koncentrációjú L-tirozin oldat, 2,5 ml 0,4 M nátrium-karbonát, 0,5 ml folin fenol reagens 5 ml-es centrifugacsőben, inkubálás 37 °C-on 30 percig, OD detektálása660az L-tirozin különböző koncentrációira, majd megkapta az Y=kX+b standard görbét, ahol Y az L-tirozin koncentrációja, X az OD600.
Számítás
2: A reakcióoldat teljes térfogata (ml)
0,5: Az enzimoldat térfogata (ml)
0,5: A kromogén meghatározáshoz használt reakciófolyadék térfogata (ml)
10: Reakcióidő (perc)
Df: Hígítás többszörös
C: Enzimkoncentráció (mg/ml)
Ábrák
1. ábra DNS-maradék
| Minta | Ave C4 | Nukleinsav Helyreállítás (pg/mg) | Felépülés(%) | Total Nucleic Sav ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNS-mentes H2O | Meghatározatlan | — | — | — |
2. ábra Optimális pH
3. ábra Optimális hőmérséklet
4. ábra pH-stabilitás
5. ábra Hőstabilitás
6. ábra Tárolási stabilitás 25 ℃-on
