EndoFree Plasmid Maxi Kit
Ez a készlet alkalmas 150-300 ml éjszakán át tenyésztett baktériumoldat extrakciójára, a baktériumok lizálására továbbfejlesztett SDS-lúgos lízis módszerrel.A nyers kivonatot szelektíven kombinálják egy egyedülálló Endotoxin Scavengerrel, és centrifugálással választják el az endotoxinok eltávolítása érdekében.Ezután a szilikagél membrán szelektíven kötődik az oldatban lévő plazmid DNS-hez magas sótartalom és alacsony pH mellett.Ezt követi a mosópuffer hozzáadása a szennyeződések és más bakteriális komponensek eltávolítására.Végül alacsony sótartalmú, magas pH-jú elúciós puffert használunk a tiszta plazmid DNS eluálására a szilíciummátrix membránról.A szilikagél membrán speciális adszorpciós membránt alkalmaz, és az oszlop és az oszlop közötti adszorpciós mennyiségkülönbség nagyon kicsi, és az ismételhetőség jó.Nincs szükség fenolra, kloroformra és más mérgező reagensekre, és nincs szükség etanolos kicsapási lépésekre sem.Ez a készlet használható 0,2-1,5 mg tiszta, nagy kópiaszámú plazmid DNS gyors extrahálására, 80-90%-os extrakciós aránnyal.A készlet egyedülálló eljárási formulával eltávolítja az endotoxint, az endotoxin tartalma rendkívül alacsony és a sejttranszfekció hatása kiváló.Az extrahált plazmid közvetlenül felhasználható enzimemésztéshez, PCR-hez, in vitro transzkripcióhoz, transzformációhoz, szekvenáláshoz és más molekuláris biológiai kísérletekhez.
Tárolási feltételek
Az RNázA-t -30 ~ -15 ℃ között kell tárolni, és ≤0 ℃ között kell szállítani.
Az Endotoxin Scavenger 2 ~ 8 ℃-on egy hónapig, -30 ~ -15 ℃-on tárolható hosszú távú tároláshoz.és ≤0 ℃-on szállítják.
A többi komponenst szobahőmérsékleten (15 ~ 25 ℃) kell tárolni, és szobahőmérsékleten szállítani.
Alkatrészek
| Alkatrészek | 10RXNS |
| RNáz A | 750 μl |
| P1 puffer | 75 ml |
| P2 puffer | 75 ml |
| Puffer P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Puffer PW | 2 × 22 ml |
| TB puffer | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi oszlopok (mindegyik 50 ml-es gyűjtőcsőben) | 10 |
| Endotoxin mentes gyűjtőcső | 2 × 5 |
RNázA:10 mg/ml, az RNS eltávolítására szolgál.
P1 puffer:bakteriális szuszpenziós puffer, az első használat előtt adjon hozzá RNázA-t a P1 pufferhez.
P2 puffer:bakteriális lízispuffer (SDS/NaOH-t tartalmaz).
P4 puffer:semlegesítő puffer.
Endotoxin-fogó:hatékonyan távolítja el az endotoxint a nyers plazmidkivonatból.
Puffer PW:mosópuffert, az első használat előtt adjon hozzá az előírt mennyiségű etanolt.
TB puffer:elúciós puffer.
FastPure DNA Maxi oszlopok:plazmid DNS adszorpciós oszlopok.
Gyűjtőcsövek 50 ml:szűrletgyűjtő csövek.
Endotoxin-mentes gyűjtőcső:plazmid DNS-gyűjtő csövek.
Előkészített anyagok
Abszolút etanol, izopropanol, 50 ml-es kerek fenekű centrifugacsövek és 50 ml endotoxin-mentescentrifuga csövek.
Alkalmazások
Ez a termék alkalmas plazmidok nagyléptékű extrakciójára 150-300 ml bakteriális oldatbóltenyésztik egyik napról a másikra.
Kísérleti folyamat
1. Vegyünk 150-200 ml (legfeljebb 300 ml) egy éjszakán át tenyésztett bakteriális oldatot, és centrifugáljukkörülbelül 11 000 ford./perc (12 000 × g) 1-2 percig.Dobja ki a felülúszót, és gyűjtse össze a baktériumokat.
Δ Ha több mint 50 ml baktériumoldatot gyűjtünk össze, a baktériumok összegyűjthetők bakteriális oldat hozzáadásával, centrifugálással, a felülúszó eldobásával és más lépésekkel ugyanabban az 50 ml-es csőben.
többször.
2. Adjon hozzá 7,5 ml P1 puffert (kérjük, ellenőrizze, hogy RNázA-t adtak-e a P1 pufferhez) a centrifugához.baktériumokat tartalmazó csövet, és alaposan keverje össze vortex vagy pipettával.
Δ Ebben a lépésben a baktériumok teljes újraszuszpendálása kritikus a kitermeléshez, és az újraszuszpendálást követően nem lehetnek bakteriális csomók.Ha vannak olyan baktériumcsomók, amelyeket nem kevertek össze alaposan, az befolyásolja a lízist, ami alacsony hozamot és tisztaságot eredményez.Ha a bakteriális oldat OD600 értéke 0,65, 150 ml baktériumoldatból történő extraháláskor 7,5 ml P1 puffert javasolt használni;ha az OD600 0,75, 8 ml P1 puffert kell használni, és a P2 és P4 puffer térfogatát ennek megfelelően módosítani kell.Ha a baktériumoldat térfogatát 200 ml-re növeljük, akkor javasolt aa P1, P2 és P4 pufferek mennyiségét arányosan növelni kell.
3. Adjon hozzá 7,5 ml P2 puffert a 2. lépésből származó baktériumszuszpenzióhoz, és óvatosan keverje fel és le 6-8 percig.alkalommal, és szobahőmérsékleten 4-5 percig inkubáljuk.
Δ Óvatosan fordítsa meg az alapos keveréshez.Az vortexelés a genomi DNS fragmentációját okozza, ami genomi DNS-fragmenseket eredményez a kivont plazmidban.Ekkor az oldat viszkózussá és áttetszővé válik, ami azt mutatja, hogy a baktériumok teljesen lizáltak.Az időtartam nem haladhatja meg az 5 percet, hogy elkerüljük a plazmidok pusztulását.Ha az oldat nem tiszta, túl sok baktérium keletkezhetnem teljes lízis, ezért a baktériumok mennyiségét megfelelően csökkenteni kell.
4. Adjon hozzá 7,5 ml P4 puffert a 3. lépés szerinti baktériumszuszpenzióhoz, és azonnal óvatosan fordítsa meg 6-8-szor, hogy az oldat teljesen semlegesítse a P2 puffert.Ekkor fehér pelyhes csapadéknak kell megjelennie.Centrifugálja kb. 11 000 fordulat/percnél (12 000 × g) nagyobb sebességgel 10-15 percig, majd óvatosan pipettázza a felülúszót egy új, 50 ml-es kerek fenekű centrifugacsőbe (saját készítésű), és kerüljeszívjuk fel a lebegő fehér csapadékot.
Δ Adjon hozzá P4 puffert, és azonnal fordítsa meg, hogy jól elkeveredjen.Hagyja állni a csövet, amíg a fehér csapadék egyenletesen el nem oszlik az oldatban, hogy megakadályozza a semlegesítést befolyásoló helyi csapadék képződését.Ha a centrifugálás előtt nincs egyenletes fehér pelyhes csapadék, és a felülúszó nem tiszta a centrifugálás után, a csövettovábbi 5 percig centrifugáljuk.
5. Adjon a 4. lépésből származó felülúszóhoz a térfogat 0,1-szeresét (a felülúszó térfogatának 10%-a, kb. 2,2 ml) Endotoxin Scavengert, majd fordítsa meg a keveréshez.Helyezze az oldatot jeges fürdőbe, vagy tegye zúzott jégbe (vagy hűtőszekrény fagyasztóba) 5 percre, amíg az oldat zavarosból átlátszóvá és átlátszóvá változik (vagy mozdulatlanná)enyhén zavaros), és időnként többször keverjük meg.
Δ Miután az Endotoxin Scavengert hozzáadták a felülúszóhoz, a felülúszó zavarossá válik, de aa felülúszónak átlátszóvá (vagy enyhén zavarossá) kell válnia a jeges fürdőben való lehűlés után.
6. Miután a felülúszót szobahőmérsékleten (>25 ℃) 10-15 percre helyeztük, zavarossá válik,hőmérséklete szobahőmérsékletre emelkedik.Ezután a felülúszót meg kell fordítani, hogy keveredjen.
Δ Ha a szobahőmérséklet alacsonyabb, vagy csökkenteni szeretné az extrakciós időt, a felülúszót 37 ~ 42 ℃-os vízfürdőben 5-10 percig inkubálhatjuk, és a következő lépést a felülúszó után lehet végrehajtani.zavarossá válik.
7. Centrifugálja a felülúszót körülbelül 11 000 fordulat/perc (12 000 × g) sebességgel 10 percig szobahőmérsékleten (a hőmérsékletnek >25 ℃-nak kell lennie) a fázis elválasztásához.A felső vizes fázis a DNS-t, míg az alsó kék olajos fázis endotoxint és egyéb szennyeződéseket tartalmaz.Vigye át aDNS-tartalmú vizes fázist egy új csőbe ésdobja el az olajos réteget.
Δ A centrifugálás során a hőmérsékletnek 25 ℃ felett kell lennie, mivel a hatékony fázisszétválasztás nemakkor fordulhat elő, ha a hőmérséklet túl alacsony.
Δ Ha a fázisszétválasztás nem hatékony, a centrifugálási hőmérséklet 30 ℃-ra állítható, ésa centrifugálás ideje 15 percre növelhető.
Δ Ne szívja fel a kék olajos réteget, mivel endotoxint és egyéb szennyeződéseket tartalmaz.
Gépezet
Újraszuszpenziós lízis semlegesítés
◇ Adjon hozzá 7,5 ml P1 puffert
◇ Adjon hozzá 7,5 ml P2 puffert
◇ Adjon hozzá 7,5 ml P4 puffert
Endotoxin eltávolítás
◇ Adjon hozzá az Endotoxin Scavenger felülúszó térfogatának 0. 1-szeresét
Kötés és mosás
◇ Adjon hozzá 0,5-szeres térfogatú izopropanolt
◇ Adjon hozzá 10 ml PW puffert
◇ Adjon hozzá 10 ml PW puffert
Elúció
◇ Adjon hozzá 1–2 ml TB puffert vagy endotoxin-mentes ddH2O-t
