Plant direct PCR Kit

Katalógusszám: HCR2020A

A Plant Direct PCR Kit alkalmas növényi levelek, magvak stb. közvetlen amplifikálására, és poliszacharidokat és polifenolokat nem tartalmazó növényminták nagy áteresztőképességű szűrésére is használható.Az irányított evolúción alapuló közvetlen amplifikációs DNS-polimeráz kiválóan tolerálja a PCR-inhibitorokat a növényekben.Eközben megőrzi a magas amplifikációs teljesítményt, amely alkalmas 5 kb-on belüli DNS-fragmensek amplifikálására.A készletben található egyedi lízispuffer A friss vagy fagyasztott növényi szövetek lizálására használható.Könnyen kezelhető, és a lizátum templátként használható az amplifikációhoz tisztítás nélkül.A rendszer védőanyagokat tartalmaz, amelyek lehetővé teszik a nyers minták hatékony felerősítését ismételt fagyasztás és felolvasztás után.2 × A Plant Direct Master Mix-hez csak primereket és sablonokat kell hozzáadnia az amplifikációs reakció végrehajtásához, ezáltal csökkentve a pipettázási műveleteket, és javítva a detektálási teljesítményt és az eredmények reprodukálhatóságát.

Alkatrészek

*A „Plant Direct Lysis Buffer B” egy opcionális reagens, amely a „Plant Direct Lysis A” puffer semlegesítésére szolgál a minták tárolási idejének meghosszabbítása érdekében.A tényleges helyzetnek megfelelően használható.

Tárolási feltételek

2 × Plant Direct Master Mix, tárolja -30 ~ -15 ℃ között, és kerülje az ismételt fagyasztást és felengedést;Növény közvetlen lízispuffer, tárolja -30 ~ -15 ℃ vagy 2 ~ 8 ℃ között.

Kísérleti folyamat

Mintafeldolgozás–Növényi Levél

Közvetlen módszer:Fiatal levelek használata javasolt.Használjon 0,5–3 mm-es rögzített átmérőjű lyukasztót, hogy kicsi és egyenletes mintát kapjon, majd adja hozzá közvetlenül a mintát a PCR rendszerhez (50 μl rendszer javasolt).Ügyeljen arra, hogy a minta a PCR-oldatban legyen, és ne a cső falánál legyen.Ha direkt PCR-t használnak hosszú fragmentumok és összetett minták amplifikálására, akkor egy kisebb átmérőjű (0,5-1 mm) minta templátként való használata segíthet jobb eredmények elérésében.

Az őrlési lízis módszere:Fiatal levelek használata javasolt.Vegyünk egy kis darab levelet (körülbelül 1-3 mm átmérőjű), tegyük 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab-be, és amennyire csak lehetséges, őröljük meg (ezt a lépést úgy is megtehetjük, hogy egy 100 µl-es pipettahegy segítségével összenyomjuk a levelet hogy pépesítse a mintát) .Ha nagyobb mennyiségű levélszövetet használnak (nem haladhatja meg a 7 mm-t), növelje a hígítópuffer térfogatát 50 μl-re.A levelek őrlése után az oldatnak zöldnek kell lennie.Rövid centrifugálás után adjon hozzá 1 μl felülúszót a PCR rendszerhez reakciótemplátként.

Termikus lízis módszer:Fiatal levelek használata javasolt.Vegyünk egy kis darab levelet (kb. 1-3 mm átmérőjű), helyezzük 20 μl Plant Direct Lysis Puffer A-ba, és melegítsük 95°C-on 5-10 percig.A nehezen lizálható leveleknél a lízis ideje megfelelően meghosszabbítható (legfeljebb 20 perc).Ha nagyobb mennyiségű levélszövetet használnak (nem haladhatja meg a 7 mm-t), növelje a hígítópuffer térfogatát 50 μl-re.Melegítés után röviden centrifugáljuk, és adjunk hozzá 1 μl felülúszót a PCR rendszerhez reakciósablonként.

Mintafeldolgozás– Vetőmag

Az őrlési lízis módszere:Használjon szikét az 5 mm átmérőjű magvak vágásához, adjon hozzá 100 μl Plant Direct Lysis Puffer A-hoz, és a mintát pipettahegygel vagy más eszközökkel őrölje meg.Röviden vortexelje és hagyja állni szobahőmérsékleten 3-5 percig.Győződjön meg arról, hogy az oltóminta belemerül a hígítópufferbe.Rövid centrifugálás után adjon hozzá 1 μl felülúszót a PCR rendszerhez reakciósablonként.

Termikus lízis módszer:Használjon szikét az 5 mm átmérőjű magvak vágásához, adja hozzá 100 μl Plant Direct Lysis Puffer A-hoz, és melegítse 95°C-on 5-10 percig.A nehezen lizálható leveleknél a lízis ideje megfelelően meghosszabbítható (legfeljebb 30 perc).Melegítés után centrifugálja röviden, és adjon hozzá 1 μl felülúszót a PCR rendszerhez reakciósablonként.

a.A megfelelő méretű minták vágásához olló vagy más szerszám is használható;ha a lyukasztót vagy az ollót újra felhasználják, minden használat előtt meg kell tisztítani 2%-os nátrium-hipoklorit oldattal a minták közötti keresztszennyeződés elkerülése érdekében.

b.Használat előtt győződjön meg arról, hogy a Plant Direct Lysis Puffer teljesen megolvadt.Ha a puffer viszkózus vagy csapadékot tartalmaz, 37 ℃-ra melegítheti, hogy használat előtt teljesen megolvadjon.

c.A templát térfogata a reakciórendszerben megfelelően beállítható a növényi anyag és a hozzáadott hígító térfogatának különbsége szerint.

Üzemi közvetlen lízispuffer

A termékben található növényi közvetlen lízispuffer A szigorúan úgy lett optimalizálva, hogy felszabadítsa a legtöbb növényi szövet genomját, és alkalmas a nyers növények rövid távú tárolására 4 °C-on.Ha a mintát hosszabb ideig (pl. 1-2 hónapig) kell tárolni, ajánlatos a felülúszót átvinni egy új EP-csőbe és -20 ℃-on tárolni.A minták stabilabb tárolása érdekében adjon azonos térfogatú Plant Direct Lysis Buffer B-t az átvitt felülúszóhoz, jól keverje össze és tárolja -20 ℃-on.A stabil tárolási idő a növénymintáktól és állapotoktól függően változik.

Reakciórendszer

a.Mg-t tartalmaz²⁺2 mM végső koncentrációban.

b.Javasoljuk, hogy minden alapozóhoz 0,4 μM végső koncentrációt használjon.A primerek túlzott használata fokozott nem specifikus amplifikációhoz vezet.

c.A felhasznált minta mennyisége a tényleges helyzetnek megfelelően módosítható.Az egy reakcióban felhasznált nyers lizált minta mennyisége a reakció teljes térfogatának 2-20%-a között állítható.Túl sok minta használata erősítési hibához vezethet.

Reakcióprogram

a.A kezdeti denaturáció (98 ℃, 5 perc) elősegíti a növényi szövetek lízisét, felszabadítva a genomiális DNS-t, amely felhasználható PCR-amplifikációhoz.Ne rövidítse le az időt és ne csökkentse a hőmérsékletet.

b.Javasoljuk, hogy a primer Tm értékével egyenlő legyen, vagy 2 ~ 4 ℃-al magasabb legyen, mint a Tm érték.Az ebben a termékben használt közvetlen amplifikációs DNS-polimeráz eltér a hagyományos Taq DNS-polimeráztól, és különleges követelményeket támaszt a reakció-illesztési hőmérséklettel szemben: a magas annealing hőmérséklet alkalmazása hatékonyan csökkentheti a nem specifikus amplifikációt és javíthatja az amplifikáció hatékonyságát.Összetett sablonok esetén a hatékony amplifikáció a lágyítási hőmérséklet beállításával és a meghosszabbítási idő meghosszabbításával érhető el.

c.Ha az amplifikációs termék hossza ≤1 kb, a kiterjesztési idő 30 mp/kb;ha az amplifikációs termék hossza >1 kb, a kiterjesztési idő 60 mp/kb.

d.Komplex minták vagy alacsony amplifikációs hozamú minták esetén a ciklusok száma megfelelően 40-50 ciklusra növelhető.

Alkalmazások

Alkalmas növényi szövetek közvetlen amplifikálására és poliszacharidokat és polifenolokat nem tartalmazó növényi minták nagy áteresztőképességű szűrésére.

Megjegyzések

Kizárólag kutatási célra.Nem használható diagnosztikai eljárásokban.

1. Nyers növényi amplifikáció vagy direkt amplifikáció esetén javasolt a tisztított genomiális DNS használata pozitív kontrollként a kísérlet megkezdése előtt, hogy megbizonyosodjon a rendszer, a primerek és a műveletek helyességéről.

2. A kitben használt közvetlen amplifikációs DNS-polimeráz erős lektori aktivitással rendelkezik.Ha TA klónozást kell végezni, ajánlott a DNS tisztítása az adenin hozzáadása előtt.

3. Primer tervezési útmutató:

a.Javasoljuk, hogy az utolsó alap a primer 3′ végénél legyen G vagy C.

b.El kell kerülni az egymást követő eltéréseket az utolsó 8 bázisban a primer 3′ végén.c.Kerülje el a hajtűszerkezeteket az alapozó 3′ végén.

d.Az előremenő és a fordított primer Tm-értéke közötti különbség nem lehet több, mint 1 ℃, és a Tm értéket 60 ~ 72 ℃-ra kell beállítani (a Tm érték kiszámításához a Primer Premier 5 használata javasolt).

e.A templáttal nem egyező további primer szekvenciákat nem szabad figyelembe venni a primer Tm értékének kiszámításakor.

f.Javasoljuk, hogy az alapozó GC tartalma 40-60%.

g.Az A, G, C és T általános eloszlásának a primerben a lehető legegyenletesebbnek kell lennie.Kerülje a magas GC- vagy AT-tartalmú régiók használatát.

h.Kerülje el az 5 vagy több bázisból álló komplementer szekvenciák jelenlétét akár a primeren belül, akár két primer között, és kerülje a 3 vagy több bázisból álló komplementer szekvenciák jelenlétét két primer 3'-végén.

én.Használja az NCBI BLAST funkciót a primer specifitásának ellenőrzésére, hogy megakadályozza a nem specifikus amplifikációt.