DNS Extraction Mini Kit
Ez a készlet optimalizált pufferrendszert és szilikagél oszlopos tisztítási technológiát alkalmaz, amely 70 bp – 20 kb DNS-fragmenseket képes kinyerni különböző koncentrációjú TAE vagy TBE agaróz gélből.A DNS-adszorpciós oszlop speciálisan adszorbeálhatja a DNS-t magas sótartalmú körülmények között.Ezen túlmenően a készlet képes közvetlenül megtisztítani a DNS-fragmenseket PCR-termékekből, enzimatikus reakciórendszerekből vagy más módszerekkel nyert nyers DNS-termékekből, és eltávolítani a szennyeződéseket, például a fehérjéket, más szerves vegyületeket, szervetlen sóionokat és oligonukleotid primereket.Biztosítani tudja, hogy a tisztítás 10-15 percen belül befejeződjön.A tisztított DNS közvetlenül felhasználható ligálásra, transzformációra, enzimemésztésre, in vitro transzkripcióra, PCR-re, szekvenálásra, mikroinjekcióra stb.
Tárolási feltételek
Tárolja -15 ~ -25 ℃ között, és szobahőmérsékleten szállítsa.
Alkatrészek
| Alkatrészek | (100 rxns) |
| Puffer GDP | 80 ml |
| GW puffer | 2 × 20 ml |
| Elúciós puffer | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Puffer GDP:DNS-kötő puffer.
GW puffer:Mosópuffer;Használat előtt adjon hozzá abszolút etanolt a palackon feltüntetett mennyiségben.
Elúciós puffer:Elúció.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNS adszorpciós oszlopok.
Gyűjtőcsövek 2 ml:Gyűjtőcsövek a szűrlethez.
Előkészített anyagok
1,5 ml-es sterilizált csövek, abszolút etanol és izopropanol (ha a DNS-fragmens ≤100 bp, adjunk hozzá 1 térfogatot
izopropanolt 1 térfogat gélre), vízfürdő.
Kísérleti folyamat
Használat előtt adjon hozzá 80 ml etanolt a GW puffer hígításához a címkén feltüntetett módon, és tárolja szobahőmérsékleten.
Gépezet
1. PCR reakcióoldat
Gél extrakciós séma: Egyenlő térfogatú puffer GDP PCR reakcióoldat-visszanyerési séma hozzáadása:Adjon hozzá 5-szörös térfogatú puffert
2. GDP Számítsa ki a gél térfogatát (100 μl egyenlő 100 mg )
Oldja fel a gélt
3. Melegítse elő 50-55 fokra℃
4. Bind Wash
Adjon hozzá 300 μl puffer GDP-t*
Adjon hozzá 700 μL GW puffert
Adjon hozzá 700 μL GW puffert
5. Elute
Adjon hozzá 20-30 μL elúciós puffert vagy ionmentesített vizet
Megjegyzések* A PCR reakciófolyadék visszanyerése e lépés nélkül
Gél extrakciós program
1. A DNS-fragmensek frakcionálására szolgáló DNS-elektroforézis után vágja ki a DNS-fragmens egyetlen csíkját az agarózgélből UV-fényben.Javasoljuk, hogy nedvszívó papírt használjon, hogy felszívja a gél látszólagos nedvességét, és minimalizálja a gélszelet méretét azáltal, hogy lehetőség szerint eltávolítja a felesleges agarózt.Mérje le a gélszeletet (mikrocentrifugacső nélkül) a térfogatának kiszámításához: A 100 mg-os gélszelet térfogata körülbelül 100 μL, feltételezve, hogy a sűrűség 1 g/ml.
2. Adjon hozzá azonos térfogatú GDP puffert, inkubálja 50-55 ℃-on 7-10 percig (a gél méretétől függően állítsa be az inkubációs időt, amíg a gél teljesen fel nem oldódik).Az inkubáció alatt kétszer fordítsa meg a csövet.
Δ 1-3 térfogat puffer GDP hozzáadása nem befolyásolja a DNS-visszanyerés hatékonyságát.Ha a kinyerendő DNS-fragmens <100 bp, 3 térfogat puffer GDP-t kell hozzáadni;amikor a gélszelet teljesen feloldódott, adjunk hozzá 1 térfogat izopropanolt és alaposan keverjük össze, majd folytassuk a következő lépéssel.
3. Centrifugálja röviden, hogy a minta a cső aljára kerüljön, helyezze be a FastPure DNA Mini Columns-G-t a 2 ml-es gyűjtőcsövekbe, majd óvatosan vigye át az oldatot legfeljebb 700 μL-rel egy alkalommal
12 000 fordulat/perc (13 800 x g) sebességgel centrifugáljuk 30-60 másodpercig.
4. Dobja ki a szűrletet, és adjon hozzá 300 μl GDP puffert az oszlophoz, inkubálja szobahőmérsékleten 1 percig, centrifugálja 12 000 fordulat/perc (13 800 x g) sebességgel 30-60 másodpercig.
5. Dobja ki a szűrletet, és adjon hozzá 700 μL GW puffert (előzetesen ellenőrizze, hogy abszolút etanolt adtunk-e hozzá!), majd centrifugálja 12 000 fordulat/perc (13 800 x g) sebességgel 30-60 másodpercig.
Δ Adjon hozzá GW puffert az adszorpciós oszlop falához, vagy adjon hozzá GW puffert a hátlaphoz, és fejjel lefelé keverje össze 2-3 alkalommal, hogy a cső falára tapadt sót teljesen leöblítse.
6. Ismételje meg az 5. lépést.
Δ A GW pufferrel kétszeri öblítés biztosíthatja a só teljes eltávolítását, és kiküszöböli a további kísérletekre gyakorolt hatást.
7. Dobja ki a szűrletet, és centrifugálja az üres oszlopot 12 000 fordulat/perc (13 800 x g) sebességgel 2 percig.
8. Helyezze az oszlopot egy tiszta, 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőbe, adjon 20-30 μL eluációs puffert az oszlopmembrán közepéhez, inkubálja 2 percig, majd centrifugálja 12 000 fordulat/perc (13 800 x g) sebességgel 1 percig.Az oszlopot eldobjuk, a kapott DNS-t -20 °C-on tároljuk.
Δ A 8. lépés felülúszójának átvitele az oszlopra, hogy újra eluálódjon, és az eluációs puffer előmelegítése 55 °C-ra (ha a DNS-fragmens >3 kb) segíthet a kinyerési hatékonyság növelésében.
PCR termékek helyreállítási programja
Ez a protokoll DNS-fragmensek PCR-termékekből, enzimatikus reakciórendszerből és más DNS-termékekből (beleértve a genetikai DNS-t) történő tisztítására alkalmazható.Ezzel az oldattal hatékonyan távolíthatók el a különféle nukleotidok, primerek, primer dimerek, sómolekulák, enzimek és egyéb szennyeződések.
1. Röviden centrifugálja a PCR-termékeket, az enzimatikus reakcióoldatot és más DNS nyerstermékeket.Pipettával becsülje meg térfogatukat, és vigye át egy sterilizált 1,5 ml-es vagy 2 ml-es csőbe.Adjon hozzá ddH2O-t, amíg a térfogat el nem éri a 100 μL-t;míg a nagy koncentrációjú genomiális DNS esetében a ddH2O-val 300 μl-re történő hígítás elősegíti a helyreállítási hatékonyság javítását.
2. Adjon hozzá 5 térfogat puffer GDP-t, alaposan keverje össze megfordítással vagy vortexeléssel.Ha a kérdéses DNS-fragmens >100 bp, további 1,5 térfogat (minta + puffer GDP) etanolt kell hozzáadni.
3. Helyezze vissza az oszlopot a gyűjtőcsőbe, vigye át a keveréket az oszlopra, centrifugálja 12 000 fordulat/perc (13 800 ×g) sebességgel 30-60 másodpercig.Ha a kevert oldat térfogata >700 µL, helyezze vissza az adszorpciós oszlopot a gyűjtőcsőbe, vigye át a maradék oldatot az adszorpciós oszlopba, és centrifugálja 12 000 fordulat/perc (13 800 × g) sebességgel 30-60 másodpercig.
4. A következő előadás a 08-1/Gel extrakciós program 5 – 8. lépésére vonatkozik.
Alkalmazások
Különféle koncentrációjú TAE vagy TBE agaróz gél;Különféle módszerekkel előállított PCR-termékek, enzimatikus reakciórendszerek vagy más nyers DNS-termékek.A visszanyert töredékek től terjedtek70 bp - 20 kb.
Megjegyzések
Kizárólag kutatási célra.Nem használható diagnosztikai eljárásokban.
1. Használat előtt adjon hozzá 80 ml etanolt a puffer GW hígításához a címkén feltüntetett módon, és tárolja szobahőmérsékleten.
2. Ha a puffer GDP könnyen kicsapódik alacsony hőmérsékletű tárolás során, akkor használat előtt egy ideig szobahőmérsékleten helyezhető el.Szükség esetén 37°C-os vízfürdőben előmelegíthetjük, amíg a csapadék teljesen fel nem oldódik, majd keverés után felhasználhatjuk.
3. Állítsa előre a vízfürdő hőmérsékletét 50 ~ 55 ℃-ra.
4. A 08-1/Gel extrakciós program 1. lépésében a gélszelet méretének minimalizálása jelentősen csökkenti az oldódási időt és növeli a visszanyerés hatékonyságát (a linearizált DNS könnyen hidrolizálódik, ha folyamatosan magas hőmérsékleten van kitéve).Ne tegye ki a DNS-gélt hosszú ideig UV-sugárzásnak, mivel az ultraibolya fény DNS-károsodást okozhat.
5. Oldja fel teljesen a gélt a 08-1/Gel extrakciós program 2. lépésében, különben a DNS-visszanyerés hatékonysága súlyosan csökken.
6. Melegítse elő az eluációs puffert vagy a ddH2O-t 55 ℃-ra, ami segít a DNS-elúciós hatékonyság javításában.Javasoljuk, hogy a DNS-t 2,5 mM Tris-HCl-t tartalmazó eluensben tároljuk, pH 7,0-8,5.
