M-MLV Neoscript reverz transzkriptáz
A Neoscript Reverse Transcriptase egy reverz transzkriptáz, amelyet a Moloney egér leukémia vírus eredetű M-MLV gén mutációs szűrésével és E. coliban történő expressziójával nyernek.Az enzim eltávolítja az RNáz H aktivitást, magasabb hőmérséklettűrő képességgel rendelkezik, és alkalmas magas hőmérsékletű reverz transzkripcióra.Ezért hasznos az RNS magas szintű szerkezetének és a nem specifikus tényezőknek a cDNS szintézisre gyakorolt kedvezőtlen hatásainak kiküszöbölésében, valamint nagyobb stabilitása és reverz transzkripciós szintézis képessége.Az enzim nagyobb stabilitással és reverz transzkripciós szintézis képességgel rendelkezik.
Alkatrészek
1.200 U/μL Neoscript reverz transzkriptáz
2.5 × First Strand puffer (opcionális)
* 5 × First-Strand puffer nem tartalmaz dNTP-t, kérjük, adjon hozzá dNTP-ket a reakciórendszer előkészítésekor
Ajánlott alkalmazás
1.Egylépéses qRT-PCR.
2.RNS vírus kimutatása.
Raktározási feltételek
-20°C hosszú távú tároláshoz, használat előtt alaposan fel kell keverni, kerülni kell a gyakori fagyasztást-olvadást.
Mértékegység meghatározása
Egy egység 1 nmol dTTP-t tartalmaz 10 perc alatt 37 °C-on poli(A)•oligo(dT) felhasználásával.25mint sablon/primer.
Minőség ellenőrzés
1.SDS-PAGE elektroforetikus tisztaság nagyobb, mint 98%.
2.Erősítési érzékenység, tételről tételre szabályozás, stabilitás.
3.Nincs exogén nukleáz aktivitás, nincs exogén endonukleáz vagy exonukleáz szennyeződés
Az első láncreakciós megoldás reakcióbeállítása
1.A reakcióelegy elkészítése
| Alkatrészek | Hangerő |
| Oligo(dT)12-18 Primer vagy Random Primera Vagy génspecifikus primerekb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Templát RNS | Összes RNS≤ 5 μg;mRNS≤ 1 μg |
| RNáz-mentes dH2O | 10 μl-re |
Megjegyzések:a/b: Kérjük, válasszon különböző típusú primereket kísérleti igényei szerint.
2.Melegítse 65 °C-on 5 percig, majd gyorsan hűtse jégen 2 percig.
3.Adja hozzá a következő komponenseket a fenti rendszerhez 20 µL össztérfogatig, és óvatosan keverje össze:
| Alkatrészek | Hangerő (μL) |
| 5 × First-Strand puffer | 4 |
| Neoscript reverz transzkriptáz (200 U/μL) | 1 |
| RNáz inhibitor (40 U/μl) | 1 |
| RNáz-mentes dH2O | 20 μl-re |
4. Kérjük, hajtsa végre a reakciót a következő feltételek szerint:
(1) Ha Random Primert használunk, a reakciót 25 ℃-on 10 percig, majd 50 ℃-on 30-60 percig kell végrehajtani;
(2) Ha Oligo dT-t vagy specifikus primereket használunk, a reakciót 50 °C-on kell végrehajtani 30-60 percig.
5.Melegítse 95 ℃-on 5 percig, hogy inaktiválja a Neoscript Reverse Transcriptase-t és leállítsa a reakciót.
6.A reverz transzkripciós termékek közvetlenül felhasználhatók a PCR-reakcióban és a kvantitatív fluoreszcens PCR-reakcióban, vagy -20 ℃-on hosszú ideig tárolhatók.
PCR Rakció:
1.A reakcióelegy elkészítése
| Alkatrészek | Koncentráció |
| 10 × PCR puffer (dNTP mentes, Mg²+ mentes) | 1× |
| dNTP-k (10 mM mindegyik dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNS-polimeráz (5E/μl) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Sablona | ≤10% első láncreakciós oldat (2 μL) |
| ddH2O | 50 μl-re |
Megjegyzések:a: Ha túl sok első láncreakció oldatot adunk hozzá, a PCR reakció gátolható.
2.PCR reakcióeljárás
| Lépés | Hőfok | Idő | Ciklusok |
| Elődenaturáció | 95℃ | 2-5 perc | 1 |
| Denaturáció | 95℃ | 10-20 mp | 30-40 |
| Lágyítás | 50-60 ℃ | 10-30 mp | |
| Kiterjesztés | 72℃ | 10-60 mp |
Megjegyzések
1.Alkalmas a fordított transzkripciós hőmérséklet optimalizálására 42 ℃ ~ 55 ℃ tartományban.
2.Jobb stabilitású, alkalmas magas hőmérsékletű reverz transzkripciós amplifikációra.Ezenkívül előnyös az RNS komplex szerkezeti régióinak hatékony átjutására.Továbbá aztalkalmas egylépéses multiplex fluoreszcens kvantitatív RT-PCR detektálásra.
3.Jó kompatibilitás különféle PCR amplifikációs enzimekkel és alkalmas nagy érzékenységű RT-PCR reakciókhoz.
4.Alkalmas nagy érzékenységű egylépéses fluoreszcens kvantitatív RT-PCR reakcióhoz, hatékonyan javítja a templátok alacsony koncentrációjának kimutatási sebességét.
5.Alkalmas cDNS könyvtár építésére.
