Vaccinia vírust gátló enzim

A Vaccinia vírus capping enzim egy rekombináns E. coli törzsből származik, amely a Vaccinia capping enzim génjeit hordozza.Ez az egyetlen enzim két alegységből (D1 és D12) áll, és három enzimaktivitással rendelkezik (RNS-trifoszfatáz és guanil-transzferáz a D1 alegység által, és guanin-metiltranszferáz a D12 alegység által).A Vaccinia vírus kupakoló enzime hatékonyan katalizálja a sapka szerkezet kialakulását, amely specifikusan képes a 7-metil-guanilát sapka szerkezetét (m7Gppp, Cap 0) az RNS 5′ végéhez rögzíteni.A kupak szerkezete (Cap 0) fontos szerepet játszik az mRNS stabilizálásában, szállításában és transzlációjában eukariótákban.Az RNS lezárása enzimatikus reakcióval egy hatékony és egyszerű módszer, amely jelentősen javíthatja az RNS stabilitását és transzlációját in vitro transzkripció, transzfekció és mikroinjekció során.

Alkatrészek

Vaccinia vírus záró enzim (10 U/μl)

10×Capping puffer

Tárolási feltételek

-25 ～- 15 ℃ tárolási hőmérséklet ( Kerülje az ismételt fagyasztási-olvadási ciklusokat)

Tárolópuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glicerin.

Mértékegység meghatározása

Egy egység Vaccinia vírus lefedő enzim az az enzimmennyiség, amely ahhoz szükséges, hogy 10 pmol GTP-t beépítsen egy 80 nt transzkriptumba 1 óra alatt 37 °C-on.

Minőség ellenőrzés

Exonukleáz:10 egység Vaccinia vírus lefedő enzim 1 μg λ-Hind III emésztett DNS-sel 37 ℃-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.

Endonukleáz:10 egység Vaccinia vírust lezáró enzim 1 μg λDNS-sel 37 °C-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.

Nickase:10 egység Vaccinia vírust lefedő enzim 1 μg pBR322-vel 37 °C-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.

RNáz:10 egység Vaccinia vírust lezáró enzim 1,6 μg MS2 RNS-sel 4 órán át, 37 °C-on, agaróz gélelektroforézissel meghatározott módon nem bomlik le.

1.coli DNS:10 egység Vaccinia virus Cappping Enzyme-t E. coli genomiális DNS jelenlétére szűrünk TaqMan qPCR alkalmazásával, az E. coli 16S rRNS lókuszra specifikus primerekkel.Az E. coli genomi DNS-szennyezettsége ≤1 E. coli genom.

2.Bakteriális Endotoxin: LAL-teszt, a Kínai Gyógyszerkönyv IV. 2020-as kiadása szerint, gélhatár vizsgálati módszer, általános szabály (1143).A bakteriális endotoxin tartalma ≤10 EU/mg legyen.

Reakciórendszer és feltételek

1. Lezárási protokoll (reakciótérfogat: 20 μL)

Ez az eljárás 10μg RNS (≥100 nt) capping reakciójára alkalmazható, és a kísérleti igényeknek megfelelően bővíthető.

I) Keverjen össze 10 μg RNS-t és nukleázmentes H2O-t egy 1,5 ml-es mikrofuga csőben 15,0 µl végtérfogatig.*10 × Lezáró puffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Melegítse 65 °C-on 5 percig, majd jeges fürdőben 5 percig.

3) Adja hozzá a következő összetevőket a megadott sorrendben

*10×sapkapuffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubáljuk 37 °C-on 30 percig, az RNS most lezárva, és készen áll a későbbi alkalmazásokra.

2. 5′ terminál címkézési reakció (reakció térfogata: 20 μL)

Ezt a protokollt az 5' trifoszfátot tartalmazó RNS jelölésére tervezték, és igény szerint bővíthető.A címke beépítésének hatékonyságát az RNS:GTP mólaránya, valamint az RNS minták GTP tartalma befolyásolja.

1) Keverjen össze megfelelő mennyiségű RNS-t és nukleázmentes H2O-t egy 1,5 ml-es mikrofuga csőben 14,0 µl végső térfogatra.

2) Melegítse 65 °C-on 5 percig, majd jeges fürdőben 5 percig.

3) Adja hozzá a következő összetevőket a megadott sorrendben.

** A GTP MIX a GTP-re és néhány markerre vonatkozik.A GTP koncentrációját lásda 3. megjegyzéshez.

4) Inkubálja 37 °C-on 30 percig, az RNS 5'-vége most meg van jelölve, és készen áll a downstream-re

Alkalmazások

1. Az mRNS lezárása a transzlációs vizsgálatok/in vitro transzláció előtt

2. Az mRNS 5' végének jelölése

Megjegyzések a használathoz

1.Az RNS oldatának a Vaccinia Cappping Enzimmel való inkubálás előtti melegítése eltávolítja a másodlagos struktúrát a transzkriptum 5' végén.Hosszabbítsa meg az időt 60 percre az ismert, erősen strukturált 5-végű átiratoknál.

2. A lezárási reakciókhoz használt RNS-t használat előtt meg kell tisztítani, és nukleázmentes vízben szuszpendálni kell.EDTA nem lehet jelen, és az oldatnak sóktól mentesnek kell lennie.

3. Az 5'-vég jelöléséhez a teljes GTP-koncentrációnak körülbelül 1-3-szorosának kell lennie a reakcióban lévő mRNS moláris koncentrációjának.

4. A reakciórendszer térfogata a ténylegesnek megfelelően növelhető vagy csökkenthető.