PNGase F
A peptid-N-glikozidáz F (PNGáz F) a leghatékonyabb enzimatikus módszer szinte az összes N-kapcsolt oligoszacharid eltávolítására a glikoproteinekből.A PNGáz F egy amidáz, amely az N-kapcsolt glikoproteinek nagy mannóztartalmú, hibrid és komplex oligoszacharidjainak legbelső GlcNAc- és aszparagin-maradékai között hasít.
Alkalmazás
Ez az enzim hasznos a szénhidrátmaradékok eltávolítására a fehérjékből.
Előkészítés és specifikáció
| Kinézet | Színtelen folyadék |
| Fehérje tisztaság | ≥95% (SDS-PAGE-ból) |
| Tevékenység | ≥500 000 U/ml |
| Exoglikozidáz | Nem észlelhető tevékenység (ND) |
| Endoglikozidáz F1 | ND |
| Endoglikozidáz F2 | ND |
| Endoglikozidáz F3 | ND |
| Endoglikozidáz H | ND |
| Proteáz | ND |
Tulajdonságok
| EK szám | 3.5.1.52(Mikroorganizmusból származó rekombináns) |
| Molekuláris tömeg | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektromos pont | 8. 14 |
| Optimális pH | 7,0-8,0 |
| Optimális hőmérséklet | 65 °C |
| Szubsztrát-specifitás | Glikozid kötések hasítása a GlcNAc és az aszparaginmaradékok között 1. ábra |
| Felismerési oldalak | N-kapcsolt glikánok, hacsak nem tartalmaznak α1-3 fukózt 2. ábra |
| Aktivátorok | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Tárolási hőmérséklet | -25 ~ -15 ℃ |
| Hő inaktiválása | Az 1 µl PNGáz F-et tartalmazó 20 µl-es reakcióelegyet 75 °C-on 10 percig tartó inkubálással inaktiváljuk. |
1. ábra A PNGase F szubsztrátspecifitása
2. ábra A PNGase F felismerési helyei.
Ha a belső GlcNAc-maradékok α1-3 fukózhoz kapcsolódnak, a PNGáz F nem tudja lehasítani az N-kapcsolt oligoszacharidokat a glikoproteinekről.Ez a módosulás gyakori a növényekben és egyes rovarok glikoproteinekjeiben.
Ckomponensek
|
| Alkatrészek | Koncentráció |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10× glikoprotein denaturáló puffer | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Mértékegység meghatározása
Egy egység (U) az az enzimmennyiség, amely ahhoz szükséges, hogy a szénhidrát >95%-át eltávolítsák 10 µg denaturált RNáz B-ből 1 óra alatt 37 °C-on 10 µl teljes reakciótérfogat mellett.
Reakciókörülmények
1. Oldjon fel 1-20 µg glikoproteint ionmentesített vízzel, adjon hozzá 1 µl 10×glikoprotein denaturáló puffert és vizet (ha szükséges), hogy a reakció teljes térfogata 10 µl legyen.
2.Inkubáljuk 100 °C-on 10 percig, majd jégen hűtjük.
3.Adjon hozzá 2 µl 10×GlycoBuffer 2-t, 2 µl 10%-os NP-40-et és keverje össze.
4.Adjon hozzá 1-2 µl PNGáz F-et és H-t2O (ha szükséges) 20 µl teljes reakciótérfogatot készítsen, és keverje össze.
5.Inkubáljuk a reakciót 37 °C-on 60 percig.
6.SDS-PAGE analízishez vagy HPLC analízishez.
