mRNS Cap2'-O-metiltranszferáz

Az mRNS Cap 2'-O-metiltranszferáz egy rekombináns E. coli törzsből származik, amely a vaccinia mRNS Cap 2'-O-metiltranszferáz génjét hordozza.Ez az enzim egy metilcsoportot ad hozzá az első nukleotid 2'-O pozíciójához, az RNS 5' végén lévő cap szerkezete mellett. Az enzim az S-adenozil-metionint (SAM) használja metil-donorként a capped RNS (cap) metilálásához. -0), ami egy cap- 1 szerkezetet eredményez.

A Cap1 szerkezet növelheti a transzlációs hatékonyságot, javítva az mRNS expresszióját a transzfekciós és mikroinjekciós kísérletekben. Ehhez az enzimhez specifikusan m7GpppN sapkát tartalmazó RNS szükséges szubsztrátként.Nem tudja hasznosítani a pN, ppN, pppN vagy GpppN 5'-végén lévő RNS-t.A kupakkal ellátott RNS előállítható in vitro transzkripcióval cap analóg alkalmazásával vagy enzimatikus capping segítségével a Vaccinia Cappping Enzyme használatával.

Alkatrészek

mRNS Cap 2'-O-metiltranszferáz (50E/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Tárolás

-25 ～- 15 ℃ a tároláshoz (Kerülje az ismételt fagyasztási-olvadási ciklusokat)

Tárolópuffer

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 % glicerin.

Mértékegység meghatározása

Egy egység az az enzimmennyiség, amely ahhoz szükséges, hogy 10 pmol 80 nt capped RNS-transzkriptumot metiláljon 1 óra alatt 37 °C-on.

Minőségellenőrző vizsgálatok

Exonukleáz: 50 egység mRNS Cap 2´ -O-metiltranszferáz 1 μg λ-Hind III emésztett DNS-sel 37 ℃-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.

Endonukleáz: 50 U mRNS Cap 2' -O-metiltranszferáz 1 μg λDNS-sel 37 °C-on 16 órán át nem eredményez degradációt, agaróz gélelektroforézissel meghatározva.

Nickase: 50 egység mRNS Cap 2´ -O-metiltranszferáz 1 µg pBR322-vel 37 ℃-on 16 órán keresztül, agaróz gélelektroforézissel meghatározva nem eredményez lebomlást.

RNáz: 50 egység mRNS Cap 2' -O-metiltranszferáz 1,6 μg MS2 RNS-sel 4 órán át 37 °C-on, agaróz gélelektroforézissel meghatározott módon nem bomlik le.

E. coli DNS: 50 egység mRNS Cap 2' -O-metiltranszferázt szűrünk aE. coli genomiális DNS-t TaqMan qPCR-rel a specifikus primerekkelE. coli 16S rRNS lókusz.AE. coli genomi DNS-szennyezettség =1E. coli genom.

Bakteriális Endotoxin: LAL-teszt, a Kínai Gyógyszerkönyv IV. 2020-as kiadása szerint, gélhatár vizsgálati módszer, általános szabály (1143).A bakteriális endotoxin tartalma =10 EU/mg legyen.

Reakciórendszer és feltételek

1. Egy 1,5 ml-es mikrofuga csőben 16,0 µl végtérfogatig keverjen össze megfelelő mennyiségű kupakkal ellátott RNS-t és RNáz-mentes H2O-t.

2. Melegítse 65 ℃-on 5 percig, majd jeges fürdőben 5 percig.

3. Adja hozzá a következő komponenseket a megadott sorrendben (a Capped RNS metilációjához

kevesebb mint 10

*10× Cappping Reaction Puffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 °C), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkubálja 37 ℃-on 1 órán át (a 200 nt-nál kisebb célfragmens esetén 2 órás inkubáció javasolt).

Alkalmazások

Az mRNS expresszió javítása mikroinjekciós és transzfekciós kísérletek során.

Megjegyzések a használathoz

1. A reakció előtt az RNS-t meg kell tisztítani és nukleázmentes vízben fel kell oldani, az oldatok nem tartalmazhatnak EDTA-t és ionokat.

2. Javasoljuk, hogy a minta RNS-t 65 ℃-on melegítse 5 percig a reakció előtt, hogy eltávolítsa a másodlagos szerkezetet a transzkriptum 5' végén.10 percre meghosszabbítható komplex 5 '-terminális szerkezet esetén.