Kétszálú RNS (dsRNS) ELISA KIT

Ez a kit egy enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA), amely biotin-sztreptavidin rendszerrel van összekapcsolva, a 60 bázispár (bp) feletti hosszúságú dsRNS kvantitatív mérésére, a szekvenciától függetlenül.A lemezt előzetesen bevonták anti-dsRNS antitesttel.A mintában jelenlévő dsRNS-t adjuk hozzá, és a lyukakon bevont antitestekhez kötődik.Ezután biotinilált anti-dsRNS antitestet adnak hozzá, amely a mintában lévő dsRNS-hez kötődik.Mosás után HRP-Streptavidint adunk hozzá, és a biotinilált anti-dsRNS antitesthez kötődik.Az inkubáció után a meg nem kötött HRP-Streptavidint lemossuk.Ezután TMB szubsztrát oldatot adunk hozzá, és HRP-vel katalizáljuk, hogy kék színű terméket kapjunk, amely a savas leállító oldat hozzáadása után sárgává változott.A sárga sűrűsége arányos a lemezen befogott dsRNS célmennyiségével.Az abszorbanciát 450 nm-en mérjük.

Alkalmazás

Ez a készlet a maradék dsRNS mennyiségi mérésére szolgál.

Kit összetevők

Tárolás és stabilitás

1. Fel nem használt készlet esetén: Az egész készlet 2 ~ 8 ℃-on tárolható eltarthatósági idő alatt.A tárolás stabilitása érdekében kerülni kell az erős fényt.

2. Használt készlet esetén: Miután kinyitotta a mikrolemezt, fedje le a fel nem használt lyukakat lemezlezáróval, és tegye vissza a nedvszívó csomagot tartalmazó fóliatasakba, zárja le cipzárral a fóliatasakot, és használat után a lehető leghamarabb térjen vissza 2-8 ℃-ra.A többi reagenst használat után a lehető leghamarabb vissza kell helyezni 2-8 ℃-ra.

Szükséges anyagok, de nem szállítjuk

1. Mikrolemez-leolvasó 450±10nm-es szűrővel (jobb, ha 450 és 650 nm hullámhosszon képes érzékelni).

2. Mikrolemez rázógép.

3. RNáz-mentes hegyek és centrifugacsövek.

Műveleti folyamatábra

Mielőtt elkezded

1. Használat előtt melegítse a készlet összes alkatrészét és mintáját szobahőmérsékletre (18-25 ℃).Ha a készletet nem használja fel egy alkalommal, kérjük, csak a jelen kísérlethez vegye ki a csíkokat és a reagenseket, és hagyja a többi csíkot és reagenst a kívánt állapotban.

2. Mosópuffer: hígítson fel 40 ml 20-szoros koncentrált mosópuffert 760 ml ionmentesített vagy desztillált vízzel, hogy 800 ml 1-szeres mosópuffert készítsen.

3. Standard: használat előtt röviden centrifugálja vagy centrifugálja a törzsoldatot.A megadott négy standard koncentrációja 5 ng/μL.Az UTP és pUTP dsRNS standardok esetében kérjük, hígítsa fel a törzsoldatot 1,0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312, 0,0156,0 pg/μL értékre STE pufferrel a standard görbe megrajzolásához.Az N1-Me-pUTP dsRNS standardok esetében kérjük, hígítsa fel a törzsoldatot 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL értékre STE pufferrel a standard görbe megrajzolásához.Az 5-OMe-UTP dsRNS standard esetében kérjük, hígítsa fel a törzsoldatot 4,2,1,0,5, 0,25,0,125, 0,0625, 0pg/μL-re STE pufferrel a standard görbe megrajzolásához.Javasoljuk, hogy a szabványokat a következő táblázatok szerint hígítsák:

4. Biotinilált detektáló antitest és HRP-sztreptavidin munkaoldat: használat előtt röviden centrifugálja vagy centrifugálja a törzsoldatot.Hígítsa őket a munkakoncentrációra hígítópufferrel.

5. TMB szubsztrátum: szívja fel az oldat szükséges adagját sterilizált hegyekkel, és ne öntse újra a maradék oldatot az injekciós üvegbe.A TMB szubsztrát érzékeny a fényre, ne tegye ki hosszú ideig fénynek a TMB szubsztrátot.

Protokoll használata

1. Határozza meg a teszthez szükséges csíkok számát.A használathoz helyezze be a csíkokat a keretekbe.Az ebben a vizsgálatban fel nem használt megmaradt lemezcsíkokat nedvszívóval együtt újra kell csomagolni a zacskóba.A hűtött tároláshoz szorosan zárja le a tasakot.

2. Adjon 100 μL-t a standard, a vakpróba és a minták hígításaiból a megfelelő lyukakba.Fedjük le a lemeztömítővel.Inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten 500 fordulat/perc rázatással.A pontos vizsgálat érdekében a mintákat STE pufferrel kell megfelelő koncentrációra hígítani.

3. Mosási lépés: Szívja fel az oldatot, és mossa át 250 μL mosópufferrel mindegyik lyukba, és hagyja állni 30 másodpercig.Dobja ki teljesen a mosópuffert úgy, hogy a lemezt nedvszívó papírra pattintsa.Mosd ki teljesen 4x.

4. Adjon 100 μL biotinilált detektáló antitest munkaoldatot minden egyes lyukba.Fedjük le a lemeztömítővel.Inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten 500 fordulat/perc rázatással.

5. Ismételje meg a mosási lépést.

6. Adjon 100 μL HRP-sztreptavidin munkaoldatot mindegyik lyukba.Fedjük le a lemeztömítővel.Inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten 500 fordulat/perc rázatással.

7. Ismételje meg a mosási lépést.

8. Adjon 100 μL TMB szubsztrát oldatot minden lyukba.Fedjük le a lemeztömítővel.Inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten Fénytől védve.A folyadék kék színűvé válik a szubsztrát oldat hozzáadásával.

9. Adjon 50 μL leállító oldatot minden lyukba.A folyadék sárgává válik a stopoldat hozzáadásával.Ezután futtassa a mikrolemez-leolvasót, és azonnal végezzen mérést 450 nm-en.

Az eredmények kiszámítása

1. Átlagolja az egyes standardok, kontrollok és minták ismétlődő leolvasásait, és vonja ki az átlagos nulla standard optikai sűrűséget.Készítsünk egy standard görbét a függőleges(Y) tengelyen az abszorbanciával és a vízszintes(X）) tengelyen a dsRNS koncentrációval.

2. Javasoljuk, hogy a számítást számítógépes görbeillesztő szoftverrel végezze el, mint például a curve expert 1.3 vagy az ELISA Calc 5 vagy 4 paraméteres nemlineáris illesztési modellben.

Teljesítmény

1. Érzékenység:

alsó kimutatási határ: ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNS esetén), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNS esetén).

a mennyiségi meghatározás alsó határa: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNS esetén), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNS esetén), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNS esetén).

2. Pontosság: Intra-Assay CV ≤10%, Inter-Assay CV ≤10%

3. Helyreállítás: 80% ~ 120%

4. Linearitás: 0,0156-0,5 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNS esetén) 0,0312-1 pg/μL (N1-Me-pUTP dsRNS esetén), 0,0625-1 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNS esetén).

Megfontolások

1. A TMB reakcióhőmérséklete és -idő kritikus, kérjük, szigorúan az utasítások szerint ellenőrizze őket.

2. A vizsgálat jó reprodukálhatósága és érzékenysége érdekében elengedhetetlen a lemezek megfelelő mosása a feleslegben lévő el nem reagált reagensek eltávolítása érdekében.

3. Használat előtt az összes reagenst alaposan össze kell keverni, és kerülni kell, hogy a minta vagy a reagensek hozzáadása közben akadozzon.

4. Ha kristályok képződtek a koncentrált mosópufferben (20x), melegítse fel 37°C-ra, és óvatosan keverje addig, amíg a kristályok teljesen fel nem oldódnak.

5. Kerülje a nátrium-azidot (NaN3) tartalmazó minták vizsgálatát, mivel az tönkreteheti a HRP aktivitást, ami a dsRNS mennyiségének alulbecslését eredményezheti.

6. Kerülje el az RNáz szennyeződést a vizsgálat során.

7. A standard/minta, a kimutatási antitest és az SA-HRP szobahőmérsékleten is elvégezhető rázás nélkül, de ez a detektálási érzékenység egyszeresére csökkenhet.Ebben az esetben azt javasoljuk, hogy az UTP és pUTP dsRNS standardokat 2 pg/μL-ről, az N1-Me-pUTP dsRNS standardokat 4 pg/μL-ről, az 5-OMe-UTP dsRNS standardokat pedig 8 pg/μL-ről kell hígítani.Ezenkívül inkubálja a HRP-sztreptavidin munkaoldatot 60 percig szobahőmérsékleten.Ne használjon lombikrázót, mert a lombikrázó pontatlan eredményt eredményezhet.

Tipikus eredmény

1. Standard görbe adatok

2. Standard görbe számítás

3. Bélésérzékelési tartomány: 0,0312-1pg/μL